Katalog » ARTYKUŁ: Izolacja DNA i RNA Moje konto     

Wyszukiwanie
Szukana fraza:
Przedział cenowy:
do
Kategorie
Baza wiedzy
Informacje
Aktualności
ARTYKUŁ: Izolacja DNA i RNA  
 
Izolacja DNA i RNA
Współczesne metody izolacji w laboratorium
naukowym i diagnostycznym
 
Metody biologii molekularnej na dobre zagościły w dzisiejszym laboratorium. Ze względu na łatwość wykonania, bardzo szybki wynik, jak i nieograniczone możliwości aplikacyjne, metody te są coraz częściej pierwszym wyborem diagnosty stającego przed zadaniem wprowadzenia nowego badania do swojego laboratorium. Na rynku oferowanych jest wiele różnorodnych testów PCR, stosunkowo łatwo też można samodzielnie zaprojektować i zwalidować własny zestaw badawczy. Pozostaje jednak zawsze problem izolacji – wygodnej i szybkiej, a jednocześnie wiarygodnej.

Metody izolacji

Istnieje wiele metod izolacji DNA i RNA, ale wszystkie polegają na zniszczeniu struktur komórkowych i wyodrębnieniu materiału genetycznego z mieszaniny zanieczyszczeń i inhibitorów reakcji enzymatycznych. Przed laty stosowano wykonane samodzielnie bufory, które miały za zadanie lizę komórek i wstępne wytrącenie zanieczyszczeń (np. białek). Następnie materiał genetyczny wytrącano przy pomocy alkoholu w niskiej temperaturze, a po odwirowaniu i wysuszeniu – rozpuszczano w wodzie. Od kilku lat jednak coraz częściej stosuje się metody izolacji nie wymagające wytrącania, w których DNA lub RNA jest separowany z zastosowaniem technik chromatografii. Ze względu na małe kolumny chromatograficzne ze złożem, obsługiwane przy pomocy wirówki lub próżni, nazywa się je metodami kolumienkowymi.

Zestawy kolumienkowe

Wiele przesłanek przemawia za stosowaniem zestawów kolumienkowych zamiast tradycyjnego wytrącania. Przede wszystkim: krótki czas wykonania procedury, łatwość obsługi i duża czystość uzyskiwanego materiału. Rynek oferuje wiele zestawów kolumienkowych, które na pierwszy rzut oka różnią się jedynie ceną. W praktyce jednak często okazuje się, że tylko najdroższe kity znanych firm pozwalają na uzyskanie zadowalającej czystości i jakości. Spośród tańszych na uwagę zasługują zestawy marki Syngen, znane pod nazwą „kolumienki.pl”. Oferują one wysoką jakość dostępną w najdroższych kitach za cenę porównywalną do tanich producentów.

Czystość izolatu

Czystość wyizolowanego DNA lub RNA to istotny czynnik wpływający na dalsze badanie uzyskanego materiału. Zanieczyszczenie DNA przez RNA i białko zafałszowują pomiary stężenia, podczas gdy pozostałości fenolu, heparyny, polisacharydów czy alkoholi są zdecydowanymi inhibitorami reakcji PCR. Czystość najczęściej sprawdza się spektrofotometrycznie przy długościach fali 280 i 230 nm poza typową dla DNA i RNA długością fali 260 nm. O ile większość zestawów kolumienkowych dobrze radzi sobie z białkami, co pozwala na uzyskiwanie współczynnika A260/A280 bliskiego 1,8 dla DNA i 2,0 dla RNA, to z zanieczyszczeniami występującymi przy 230 nm bywa gorzej, szczególnie w przypadku słabszych zestawów kolumienkowych lub izolacji magnetycznej. Istnieją jednak tańsze zestawy kolumienkowe gwarantujące czystość DNA i RNA równie wysoką, jak w przypadku drogich kitów dostępnych na rynku, co sprawdzono w laboratorium Akademii Medycznej we Wrocławiu (rys. 1).

 
Rys. 1. Wyniki pomiaru spektrofotometrycznego na aparacie Picodrop RNA izolowanego z komórek hodowanych in-vitro (A) oraz DNA izolowanego z bakterii (B) zestawami „kolumienki.pl” oraz zestawami producenta Q. Badanie ekspresji GAPDH metodą real-time PCR na aparacie Rotor-Gene Q w RNA izolowanym z komórek hodowanych in-vitro (C) zestawami „kolumienki.pl” oraz zestawami producenta Q.

Wydajność izolacji

Wydajność izolacji, zwana również wydajnością DNA lub RNA, to ilość uzyskiwanego materiału genetycznego w stosunku do ilości próbki użytej do izolacji. Powszechne przekonanie, że „dobra izolacja” daje dużą wydajność jest o tyle błędne, że wraz ze wzrostem wydajności zawsze maleje czystość uzyskiwanego materiału. Ponadto największy wpływ na wydajność izolacji ma rodzaj próbki, w drugiej kolejności zaś – użyta metoda.

Homogenizacja

Tkanki ludzkie, zwierzęce i roślinne bezwzględnie wymagają homogenizacji, czyli mechanicznego zniszczenia struktur komórkowych, przed etapem lizy chemicznej i enzymatycznej. Najczęściej stosowaną metodą homogenizacji jest ucieranie tkanki w ciekłym azocie. Alternatywnie stosuje się elektryczny homogenizator kulkowy, który ze względu na jednorazowe probówki i kulki, zapewniające brak kontaminacji między próbkami, znajduje idealne zastosowanie w biologii molekularnej. Jeszcze inne rozwiązanie oferowane jest w zestawach „kolumienki.pl”. Zawierają one jednorazowe plastikowe homogenizatorki do ucierania tkanki bezpośrednio w eppendorfce. W laboratorium Akademii Medycznej we Wrocławiu porównano te dwa ostatnie sposoby homogenizacji (rys. 2). Przy użyciu obu metod homogenizacji i obu zestawów do izolacji uzyskano takie same wyniki.

Rys. 2. Wyniki pomiaru spektrofotometrycznego na aparacie Picodrop DNA izolowanego z tkanki mięśniowej zestawami „kolumienki.pl” oraz zestawami producenta Q, z homogenizacją wykonaną plastikowymi homogenizatorkami zawartymi w zestawach „kolumienki.pl” oraz homogenizatorem kulkowym TissueLyser.

Wymazy, surowica i płyny ustrojowe

W przypadku izolacji DNA lub RNA z wymazów, surowicy i innych bezkomórkowych płynów ustrojowych w zasadzie trudno oceniać wydajność izolacji na podstawie pomiaru spektrofotometrycznego, gdyż ilość materiału po izolacji jest zbyt mała. Z tego względu w laboratoriach wirusologicznych, w których wymazy i surowica stanowią niemal 100% próbek, często nie wykonuje się pomiaru stężenia po izolacji. Jak jednak określić, czy izolacja z wymazu przebiegła prawidłowo? Doskonałym rozwiązaniem tego problemu jest endogenna kontrola wewnętrzna, coraz powszechniej stosowana w komercyjnych zestawach diagnostycznych real-time PCR, na przykład w zestawach do wykrywania grypy marki Kogene. Najczęściej jest to reakcja przebiegająca w oddzielnym kanale, wykrywająca własny materiał genetyczny badanego pacjenta, podczas gdy w kanale głównym przebiega właściwa reakcja, wykrywająca poszukiwany patogen. W laboratorium grypy wrocławskiego Sanepidu porównano techniką real-time PCR wydajność izolacji materiału wirusowego z wymazów zestawami marki Syngen oraz drogimi kitami dostępnymi na rynku (rys. 3). Przy użyciu obu zestawów do izolacji uzyskano takie same wyniki.

Rys. 3. Wyniki reakcji RT i real-time PCR w aparacie Rotor-Gene Q przy pomocy zestawu do diagnostyki grypy A firmy Kogene na RNA wirusa grypy A wyizolowanym z wymazu z gardła zestawami wirusowymi Syngen „kolumienki.pl” oraz producenta Q.

Diagnostyka wirusologiczna

Pracownia wirusologiczna często stoi przed zadaniem jednoczesnego oznaczenia kilku wirusów w tej samej próbce, np. HBV i HCV. Przy wyborze zestawu kolumienkowego warto zwrócić uwagę na możliwość jednoczesnej izolacji wirusowego DNA i RNA. Izolując w taki sposób potrzebujemy dwukrotnie mniejszej próbki, oszczędzamy połowę czasu i unikamy błędu wynikającego z różnych wydajności dwóch oddzielnych izolacji. Na rynku znajduje się kilka zestawów do jednoczesnej izolacji wirusowego DNA i RNA z wymazów, surowicy i innych płynów ustrojowych. Zestawy „kolumienki.pl” poza doskonałą wydajnością nie wymagają w procedurze bloku grzejnego, co dodatkowo ułatwia pracę.

Podsumowanie

Izolacja DNA i RNA, proces często bagatelizowany, ma istotny wpływ na wiarygodność otrzymywanych wyników diagnostycznych. Skuteczne usunięcie zanieczyszczeń i inhibitorów reakcji PCR, wydajność izolacji wystarczająca do wszystkich testów oraz ochrona DNA i RNA przed degradacją – dobry zestaw do izolacji spełni nasze trzy życzenia.

Mikołaj Gmyr
 
 
Dalej
Koszyk
... jest pusty
KATALOG
Logowanie
Kontakt
FAX
faks 71 349 70 33
Tel
tel. 71 349 70 13
Tel
tel. 71 349 91 66
Tel
tel. 71 349 91 67
Godziny działania sklepu
9.00-16.00
CENNIK
Promocje
Tipsy 1000 ul typu long
Tipsy 1000 ul typu long

66,96 zł
28,00 zł netto
30,24 zł brutto
Zbieraj punkty
Biuletyn
Chcesz być na bieżąco informowany o nowościach w sklepie ? Podaj nam swój e-mail aby otrzymywać sklepowy biuletyn.
E-mail:
Twoje imię:
  20-09-2017     300629 wywołań od 23-07-2012  
Copyright © 2012 oscGold Wykonanie: itp.wroc.pl
Strony www Wrocław